Gadung (Dioscorea hispida Dennst.) merupakan tanaman umbi yang mengandung dioskorin, senyawa alkaloid yang beracun bagi manusia tetapi berpotensi dalam peningkatan produksi amilase yang menggunakan bakteri. Amilase adalah salah satu enzim yang banyak digunakan dalam industri makanan minuman juga bidang bioteknologi. Produksi enzim amilase dapat menggunakan berbagai sumber karbon, salah satunya dari umbi gadung. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui tingkat produksi enzim amilase yang menggunakan bakteri Bacillus sp. dengan substrat tepung gadung. Penelitian ini menggunakan desain eksperimen dengan Rancangan Acak Lengkap 2 perlakuan yaitu penambahan substrat tepung gadung 5%, pati gadung 5% dan tapioka 5%. Hasil penelitian menunjukkan pengaruh penggunaan tepung gadung yang tidak dilakukan perendam atau perlakuan dan banyak mengandung senyawa dioskorin menghasilkan kadar gula reduksi yang tinggi sehingga total aktivitas dan rendemen enzim amilase yang didapatkan juga tinggi dibandingkan dengan sampel yang lainnya yaitu dari tepung dan pati gadung yang lebih sedikit mengandung dioskorin.
